茶树阶段性返白现象的研究—RuBP羧化酶与蛋白酶的变化*

蒸酶绿茶。

提要　安吉白茶(Camellia sinensis)是具有阶段性返白现象的温敏突变体。利用SDS-PAGE电泳分析了返白和复绿过程中各阶段叶片可溶性蛋白组分，尤其是RuBP羧化酶大、小亚基的变化，并利用同位素法测定了此过程中RuBP羧化酶活性的变化。利用内源基质法测定了蛋白酶活性的变化，并分析了其变化与蛋白质源库代谢、叶绿素变化之间的相关性。发现安吉白茶在返白与复绿过程中叶片可溶性蛋白的主要变化是RuBP羧化酶大、小亚基含量上的差异，这种差异与RuBP羧化酶活性的变化是相一致的。同时返白阶段蛋白酶活性较高，可溶性蛋白含量降低，是造成游离氨基酸总量明显积累的直接原因。

关键词　安吉白茶；阶段性返白；温敏突变体；蛋白酶； RuBP羧化酶

Studies on the Stage Albescent Phenomenon in Tea

——the Changes of RuBPcase and Proteinase

Li Sufang　Chen Ming　Yu Fulian　Cheng Hao

(Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou　310008)

Abstract　The variation of large and small subunits of RuBPcase from temperature-sensitive mutant of Anjibaicha (Camellia sinensis) during its stage albescent process was investigated as well as the changes of the enzyme activities. The relationship between the levels of the RuBPcase subunits and the activities of proteinase was also discussed. It was found the levels of both large and small subunits were low at the albescent stage and became normal after leaves recovered to green, which corresponded with the enzyme activity change. Meanwhile, the high activity of protease and the lowering of leaf soluble protein content. At the albescent stage were the direct reasons for the accumulation of free amino acids.

Key words　Anjibaicha；Stage albescent mutation；Temperature sensitive mutant；Proteinase； RuBPcase

我们业已报道了温敏叶色突变体安吉白茶在返白过程中伴随着叶片色素含量的可逆性变化，其茶多酚含量、氨基酸含量与组成等都有对应的相关变化〔1，2〕，尤其是返白阶段的氨基酸总量比对照品种高出许多，使以此突变体为原料制作的成品茶滋味较为鲜爽；不仅如此，在返白与复绿过程中还有叶绿体数量分布和叶绿体超微结构〔3〕的可逆性变化。但以安吉白茶无性系群体所产的种子进行繁殖的有性后代在白化性状上出现了分离，大多数种子后代不再具有返白特征，只有少量种子苗能保持其返白现象。本文主要探讨了在安吉白茶返白与复绿过程中，叶片RuBP羧化酶和蛋白酶的变化情况。

1　材料与方法

1.1　试验材料

种植在杭州中国农业科学院茶叶研究所苗圃和浙江省安吉县林科所白茶基地的无性系安吉白茶茶苗。并采用种植于本所苗圃的安吉白茶部分实生绿苗作为可溶性蛋白组分分析的对照材料。

1.2　试验方法

1.2.1　叶片可溶性蛋白组分分析

1.2.1.1　叶片可溶性蛋白提取　白茶和对照样各500mg，液氮冻干。加3.5ml可溶性蛋白提取液(30mmol／L Tris-HCl，pH 8.7；1mmol／L DTT；1mmol／L EDTA；5mmol／L MgCl2)、0.1g水不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及少量石英砂，冰浴研磨。4℃，8640r／min离心10min。取200μl，加1ml冷丙酮（内含10mmol／L巯基乙醇），摇匀后置于-20℃冰箱1h，用TGL-16离心机10000r／min离心5 min，收集沉淀，减压干燥，-20℃保存备用。

1.2.1.2　可溶性蛋白SDS-PAGE凝胶电泳〔8〕　浓缩胶浓度3%，分离胶浓度12%，含0.1%SDS。电泳后，凝胶用0.25%考马斯亮蓝R250、50%甲醇、10%乙酸固定染色6h，然后用7%乙酸和15%甲醇脱色。胶片用岛津CS-930薄层扫描仪595nm波长扫描。分子量测定用低分子量标准蛋白含兔磷酸化酶B(97400 u)、牛血清白蛋白(66200 u)、兔肌动蛋白(43000 u)、牛碳酸酐酶(31000 u)，胰蛋白酶抑制剂(20100 u)和鸡蛋清溶菌酶(14400 u)。

1.2.1.3　可溶性蛋白含量、蛋白酶活性与游离氨基酸测定　可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝染料结合法〔6〕，在岛津UV-265分光光度计上测吸光值，并计算蛋白浓度。蛋白酶活性测定采用内源基质法〔7〕。游离氨基酸含量测定用国标法GB8312-87。

1.2.2　RuBP羧化酶提取及酶活力测定

1.2.2.1　RuBP羧化酶提取〔4,9〕　鲜叶去叶脉，液氮冷冻24h，再保存于-30℃冰柜待用。取10g上述保存的材料，加入80ml预冷的新鲜提取液（50mmol／L磷酸缓冲液，pH7.4，内含1mmol／L EDTA，5mmol／L巯基乙醇，10%甘油)，及2g水不溶性PVP，预冷的组织捣碎机匀浆，快速5s，慢速5s，重复3次。然后经4层预冷纱布过滤，滤液经11900r／min离心20min，收集上清。

1.2.2.2　RuBP羧化酶活力测定　采用同位素方法测定。总体积为800μl的反应混合液含100μmol Tris-HCl缓冲液(pH7.8)，10μmol MgCl2，8μmol NaH14CO2 (2μCi)，2μmol DTT和100μl上述提取的RuBPcase酶液。25℃预温10min使酶活化，加入0.5μmol RuBP使反应开始。5min后，加入800μl HCl终止反应,90℃烘箱干燥。PACKARD 1900CA双道液体闪烁计数器测定，按以下公式计算酶活力：

U=DPM×3.997×60×V／(2.22×106×5×10-1)(CO2μmol.g-1.h-1FW)

式中：3.997为每微居里(μCi)14C相当于CO2的微摩尔数(μmol)；60为分钟数(min)；V为每克鲜重植物得到的酶液原液的体积(ml)；2.22×106为每分钟内1μCi14C的蜕变数；5为反应时间(min)；10-1为反应体积中酶液的体积(ml)。

2　结果与分析

2.1　叶片可溶性蛋白的电泳分析

叶片可溶性蛋白组分测定材料为本所苗圃3年生茶苗，自4月9日起每隔一周取样至5月16日叶片复绿时止。各时期样品电泳后进行比较，未能发现有明显的组分变化，仅发现有两条带的强度在不同时期有显著差异。将电泳胶片在薄层扫描仪上扫描后，其结果(图1)证实这两条带的含量在白化期与复绿后差异较大。根椐与低分子量标准蛋白质的对比计算，确定它们的分子量分别为54.2ku和14.9ku左右。经与菠菜RuBP羧化酶提纯品的多次比较，确认其为RuBP羧化酶大、小亚基。由图1可见，白茶突变体RuBP羧化酶大、小亚基含量在白化初期与全白期均处于较低水平，复绿后急剧升高，两个亚基的变化幅度基本相近。

因为安吉白茶突变体原发现于安吉山区一农家茶园，已无法找到产生这一突变体的原茶树种群来作为对照，为确证这种RuBP羧化酶大、小亚基含量的变化确实是与突变体的返白性状有关，而不是叶片本身发育的原因，选择了安吉白茶突变体的种子后代中不表现返白特性的植株作为对照，对比了突变体与其有性后代在各时期RuBP羧化酶大、小亚基含量上的差别。种子后代叶片可溶性蛋白电泳胶片的扫描结果如图2所示。根椐电泳图谱的对比，也未能发现白茶突变体与其有性后代在叶片可溶性蛋白组分上有明显差异，但作为对照的突变体有性后代RuBP羧化酶两亚基在各时期的水平基本没有变化，与白茶复绿期水平接近，大大高于白茶返白期水平。该结果与对照植株不表现白化突变的现象一致，说明白茶RuBP羧化酶亚基的含量变化确实是由突变引起的。

EA：返白初期；FA：全白期；HG：复绿中期；FG：全复绿期；LS：RuBP羧化酶的大亚基；SS：RuBP羧化酶的小亚基

EA: Early albescent stage; FA: Fully albescent stage; HG: Half green stage; FG: Fully green stage；LS: The large subunit of RuBPcase; SS: The small subunit of RuBPcase

图 1　安吉白茶突变体返白过程不同阶段叶片可溶性蛋白SDS-PAGE电泳结果扫描图

Fig.1　SDS-PAGE scanning profiles of soluble leaf proteins during Anjibaicha albescent progress

EA：相当于白茶返白初期； FA：相当于白茶全白时期；FG：相当于白茶全复绿时期；LS：RuBP羧化酶的大亚基；SS：RuBP羧化酶的小亚基

EA: The same time to early albescent stage; FA: The same time to fully albescent stage;FG: The same time to fully green stage；LS: The large subunit of RuBPcase; SS: The small subunit of RuBPcase

图 2　安吉白茶有性后代不同阶段叶片可溶性蛋白SDS-PAGE电泳结果扫描图

Fig.2　SDS-PAGE scanning profiles of the soluble leaf proteins of Anjibaicha seedling progenies

2.2　返白过程中RuBP羧化酶的活性变化

为进一步确证RuBP羧化酶在返白与复绿过程中的变化，采用同位素方法测定了白茶突变体返白过程各时期RuBP羧化酶的活性。其结果(图3)表明该酶活性在返白初期即较低，随叶片返白程度的加深又略有下降，然后又随叶片的逐步复绿而渐渐升高，其变化趋势与返白过程中叶绿素的变化完全一致。这一结果不仅与叶片可溶性蛋白的电泳结果一致，也和已观察到的返白复绿过程中叶绿体结构的解体与恢复现象〔3〕一致，说明安吉白茶在返白期叶绿体的结构与功能同时受到了严重的破坏，而在复绿期又得到了重建。

EA：返白初期；FA：全白期；SG：复绿初期； HG：复绿中期；FG：全复绿期

EA: Early albescent stage; FA: Fully albescent stage; SG: Slightly green stage; HG: Half green stage; FG: Fully green stage

图 3　安吉白茶不同返白复绿阶段RuBP羧化酶活性的变化

Fig.3　Variation of RuBPcase activity at the different albescent stages of Anjibaicha

2.3　返白过程中蛋白酶的变化

RuBP羧化酶大、小亚基含量的同时下降提示我们需对蛋白的降解作一分析，为此测定了白茶突变体返白与复绿各阶段蛋白水解酶的活性、可溶性蛋白含量和游离氨基酸总量。其结果(图4)表明，与随后的复绿阶段相比，返白期蛋白水解酶活性总体较高，可溶性蛋白含量较低，两者有较好的负相关性；而总游离氨基酸明显积累，其峰值与蛋白水解酶活性最大值几乎同时出现。而复绿后蛋白水解酶活性逐步降低；与此对应，可溶性蛋白含量随复绿过程逐步升高，同时游离氨基酸含量下降，游离氨基酸库容的变化与可溶性蛋白含量变化呈较好的负相关性。因此安吉白茶在返白阶段游离氨基酸库容的增大，很可能是由于蛋白酶活性的增大，导致了蛋白质的大量水解引起。

EA：返白初期；FA：全白期；HG：半复绿期；FG：全复绿期

EA: Early albescent stage; FA: Fully albescent stage; HG: Half green stage; FG: Fully green stage

图 4　安吉白茶不同返白复绿阶段可溶性蛋白,游离氨基酸和蛋白酶活性变化

Fig.4　Variation of proteinase activity, soluble protein level and free amino acid content at the different albescent stage of Anjibaicha

3　讨论

RuBP羧化酶是一种重要的叶蛋白，几乎占叶片可溶性蛋白的50%左右，催化光合作用中CO2的固定。安吉白茶在返白与复绿过程中叶片可溶性蛋白的主要变化是RuBP羧化酶大、小亚基含量上的差异，这种差异与RuBP羧化酶活性的变化是相一致的，与返白过程中蛋白酶活性的变化呈负相关关系。许多学者认为，RuBP羧化酶是植物蛋白酶水解的最佳底物，因此造成RuBP羧化酶大、小亚基含量在白化期下降的原因，很可能是由于突变诱发的蛋白酶活性升高导致了RuBP羧化酶蛋白的大量水解。因此，蛋白酶活性在白化期的显著上升是安吉白茶白化期氨基酸总量增加的直接原因。

高等植物的RuBP羧化酶是一个由核基因和质体基因共同编码的基因产物，其大亚基的合成由叶绿体基因组中单一基因编码，而小亚基的合成则由核基因组中的多基因编码。在水稻中，由叶绿体基因组缺失所导致的花培白化苗，其RuBP羧化酶大亚基水平极低而小亚基较为正常〔5〕，而核基因突变产生的水稻白绿苗〔5〕，则两个亚基同时受到影响。安吉白茶在其返白与复绿过程中，RuBP羧化酶大、小亚基含量基本上同时下降与上升，与水稻白绿苗的情形较为类似。且其种子后代中只有少量种子苗能够保持返白特征，因此安吉白茶的返白突变不可能是仅仅由于质体基因组突变产生。

*国家自然科学基金与浙江省自然科学基金资助项目。

cy316.cOM编辑推荐

一个世纪以来氧化酶研究的进展(续)

李荣林方辉遂

(浙江农业大学茶学系310029)

--------------------------------------------------------------------------------

Abstract

The　investigation　on　polyphenol　oxidase　intea　sphere　has　been　startedsince　the　blackteafermentation.Yhe　tea　fermentation　was　historicalyconsidered　as　the　action　of　microorganisms.Afterthen,it　was　gradually　revealledthatthefermentation　is　the　function　of　the　internalenzymes　in　tea.Finally,it　was　confirmed　thatthis　process　is　mainly　completed　by　polyphenoloxidase.Owing　to　its　special　position　in　tea　processing,polyphenol　oxidase　.Owing　to　its opecial　position　in　tea　processing,polyphenol　oxidase　has　been　uninterruptedly　studied　in　teasphere　since　the　end　of　18　century　and　theresearch　ckntent　has　been　greatly　enlarged　anddeepened.This　paper　tried　to　summarixe　theresearch　achievements　on　tea　polyphenol　oxidase　in　past　one　century

.

四、80年代以来的进展

80年代以来对茶叶多酚氧化酶的研究依然兴趣不减，1980年前苏联学者Лруцлзе　ГН在早期探索的基础上进一步提出萎凋时PPO分子形态可能发生了变化，PPO可以有高分子态和低分子态两种，萎凋时多酚酶可能发生低分子态向高分子态转化，使总酶活提高［３１，７

３］。1981年UllahMA提出萎凋时酶活因失水而下降，用适当的方法复水可使酶活得到一定程度恢复58，59］，1986年萧伟祥指出，近期的研究中关于萎凋时PPO活性变化趋势出现了两种完全相反的结论，他认为这是酶提取方法不同所致。丙酮粉法测出的是总酶活，而匀桨法测出的是可溶性的活性。萎凋时可溶性酶活性下降，而总酶活上升［53］。1988年刘仲华研究表明，用丙酮粉法提取酶浸提与不浸提相比酶活有很大不同，浸提12小时酶提取液活力几乎提高一倍［65,66］。实际上早先Roberts已经观察到类似结果［16］。1986年萧伟祥对红茶中残留酶作了详细研究，发现PPO在成品茶中仍有一定活性(31，32)。1981年DixMA用葡萄糖凝胶测定了POD和PPO的分子量，以蓝色糊精等进行校正，01NKCl柠檬酸洗脱，PPO在12Vc有一弱肩峰，分子量142000，另一峰在139Vc，分子量71000，证明PPO具有高分子态和低分子态两种状态。以后有人用高速离心法测定出PPO分子量，如以U(偏微分比容)07-078计算，PPO分子在128000-160000之间，即144000±160000［31］。80年代以来多酚氧化酶同工酶研究受到进一步重视。茶的多酚氧化酶同工酶研究始于60年代中期，1965-1966年竹尾用淀粉凝胶把PPO分成3个组分［45］，1966年Ｇｒｅｇｏｒｙ用Ｇ１５０也得到3条同工酶。1981年刘维华用聚丙烯酰胺凝胶电泳［62］，1983年安徽农学院茶叶系用圆盘电泳［31］分别从萎凋叶中获得了5条同工酶。1988年叶庆生研究发现萎凋中总酶活下降，而且所得6条同工酶活性也呈下降趋势(65)。1988年胡振长研究了杀青过程中多酚氧化酶同工酶的变化，发现杀青后仍存在1-2条同工酶［67］，1989年刘仲华研究了红茶制造过程中多酚氧化酶同工酶的动态，证实萎凋中有新的同工酶产生［65］。

1990年施兆鹏研究了黑茶制造过程中多酚氧化酶的变化，结果表明杀青后同工酶由6条减为2条，至渥堆开始时这两条同工酶也消失，渥堆12小时有新的同工酶出现，作者认为这是微生物分泌出多酚氧化酶的结果［69］。

1988年屠幼英测定了多酚氧化酶同工酶的等电点［70］，1991年又测定了各同工酶分子量74］。1990年谭振初［71］,刘仲华［69］各自独立地证明柠檬酸可促使多酚氧化酶活化。稍早一些时候Ｔｏｃｋｌａｉ试验站Ｃｈｏｕｇｈｕｒｒｙ　Ｍ．提出果胶质和果胶酶能抑制PPO活性(51)。

1990年屠幼英、吴小崇证实萎凋时可溶性PPO活性下降，而PPO总酶活性上升，但这种变化与失水无关，萎凋中确有新的同工酶出现，已糖激酶能够促进萎凋叶多酚氧化酶活性的提高而抑制鲜叶多酚氧化酶的活性［72］。1991年屠幼英总结了PPO抑制剂的类型，有硼砂、酚类、亚硫酸钠、Vc、半胱胺酸、二乙基二硫代硫酸钠等［70］。80年代以来多酚氧化酶同工酶在茶树育种和生理上的应用取得显著进展。前苏联学者曾提出PPO活力和PPO酶蛋白含量可作为发酵力的指标［76］，我国学者龚景文、陈兴琰(1988)研究了若干茶树品种POD、PPO以及酯酶同工酶的差异，认为同工酶可作为品种分类的依据［77］。浙江农业大学茶学系(1988)建立了同工酶数据处理方法（76）。黄惠华(1991)研究了PPO的等电点，发现叶与花的同工酶等电点基本无异，可以视为遗传特征［76］。

1983年鸟屋尾忠之等人研究了PPO与茶树遗传的关系，认为PPO至少受两组基因的控制，作者估算了PPO广义遗传力和狭义遗传力的大小［79］。

1987年杨跃华研究了同工酶变化与茶抗逆的关系，认为逆境下茶树各酶系统包括PPO都有新的同工酶产生［79］，唐继平(1987)［81］，StephenSN/(1990)［88］研究了杂交后代PPO遗传的关系，指出PPO主要受优势亲本的左右。

1992年SinghHP研究了花器中多酚氧化酶的变异，结果表明整个花期中PPO在花器中的分布及同工酶特征都保持稳定，因此花器中PPO的特征可作为选种的依据［89］。

1993年王利琴用圆盘电泳分析了PPO同工酶与遗传的关系［82］。新近奚彪等提出用基因工程方法改变茶树体内PPO存在状态的设想［95］。

虽然已可以肯定红茶的变色过程中微生物不起主要作用，但微的可能作用仍不应忽视。

1973年富金原考由绿茶分离出两种产PPO菌株，枝孢霉(Ａｌｔｅｒｎａｒｌｌａ　Ｔｅｎｎｉｓ)和链孢霉（Ｃｌａｄｏｓｐｏｓｉｕｍ　Ｃ．）［８７］，苏联学者也分离到两株高产菌：Ｍａｃｅｉｌｉａｉｒ，Ｃｏｒｉｏｕｌｏｕｓ　Ｈｉｒｓｕｔｕ［83，86］

。1987年加藤和冈本顺子研究了微生物PPO用于茶发酵的可行性［84］

。1992年印度学者从茶树叶片中分离出具有较高PPO的活性的7株真菌和3株细菌，并认为细菌更有前途［95］。1990年施兆鹏在研究黑茶渥堆中的PPO活性变化时也曾推测微生物在渥堆叶中分泌了多酚氧化酶［69］，所有这些研究为微生物在茶叶制造中的作用提供了新见解。

1983年李名君［86］，1985年Ｊｅｎｉｓｈ　Ｃ［90］分别对茶叶中已知的酶系作了全面综述，1988年曾洪涛、刘仲华、李远志、张堂恒各自从不同角度讨论了茶叶加工中多酚氧化酶的应用问题［84，85，86］，刘乾刚对多酚氧化酶定位问题作了总结［94］。1992年Obenda从植物生理角度讨论了茶的多酚氧化酶ＣａｔｃｈｏｌＯｘｄｓｓｅ区别于Tｙｒｏｓｉｎａｄｅ(酪氨酸氧化酶)，Ｌａｃｃａｓｅ(漆酶)的独特性质［89］。1993年曾晓雄，1996年李荣林对茶叶加工中酶的利用现状和前景作了展望，侧重介绍了单宁酶和多酚氧化酶研究和利用中存在的问题［93，95］。

在茶叶加工中单宁酶的应用早已成功，并已应用了固定化酶，受此启发1981年ＰｒａｂｈａＴ．研究了芒果和茶叶多酚氧化酶的固定化［90］。1992年前苏联学者Ｃｈｉｎｄｉｌｉｓ　Ａ．研究了多酚氧化酶酶电极的制作技术及酶电极法测定儿茶素的方法［91］。中国和日本学者也开展了相应研究［95］。一般认为茶的多酚氧化酶是一种邻二酚氧化酶，但已有证据表明茶叶的氧化酶提取物确有单酚氧化酶和三元酚氧化酶的活性，可以催化对香豆酸和焦酚的氧化。这表明茶多酚氧化酶是一个复杂的体系［95］。

一个世纪以来茶多酚氧化酶研究的进展是巨大的，但仍有众多的问题需要解决，特别是PPO的生理功能——末端氧化酶的真正地位问题至今仍缺乏明析的概念。与此相关的问题是多酚氧化酶的底物——茶多酚类物质的生理功能的研究仍相当贫乏。此外有关该酶的分子结构的研究

云南耿马蒸酶茶介绍

耿马蒸酶茶是云南省临沧市耿马县的特产。蒸酶茶具有外形条索紧直，茶叶汤色碧绿，清澈明亮、滋味清香回甘，经久耐泡，内含物质丰富，消暑解渴、美容、益寿、助消化、防衰老、抗辐射、实为茶叶中之珍品。

云南耿马蒸酶茶（集团）有限公司生产的“回味牌”蒸酶茶系列产品，是采用耿马得天独厚的生态条件，以云南大叶种优质有机茶为原料，采用先进独特的工艺技术精制而成，该产品具有外形圆晖紧结，茶晶微霜显露，汤色鲜绿明亮，滋味鲜香可口，具有玉米香型、板栗香型、清香型等多种香气成分，饮用后令人回味不已等特点，而且含有多种有益人体健康的营养物质。其产品主要品种有银针茶、银钩茶、露珠茶、蒸酶茶、碎绿茶、勐撒蒸绿茶，名优茶有青山碧剑、绿海雪芽、勐撒翠螺、毛峰茶、月之芽茶。

“回味牌”蒸酶茶系列产品，自开发投产问市以来，一直深受广大消费者欢迎，曾被云南消费者协会评为“消费者最喜爱产品“称号，从而成为云南名牌产品，并先后多次获得国际国内举办的各种博览会金奖，同时被联合国技术信息促进系统中国国家分部评为“优秀民营企业”称号，2003年7月荣获“全国质量服务消费者满意企业”称号和“全国质量信得过产品”称号，2003年10月我公司使用的《.回味牌》注册商标，荣获首届“云南省著名商标”称号，并得到重点保护。其产品主要销往省内昆明、丽江、楚雄、曲靖、大理、昭通等地，国内销往上海、辽宁、福建、安徽、河南、广东、贵州、四川、重庆等城市，国外销往日本、缅甸待国，部分作为馈赠补品送往泰国、美国、新加坡、马来西亚和港澳台地区。

茶树生理特性：茶树的休眠现象

休眠是茶树对不良环境条件的一种适应方式。当外界条件对生长适宜的时候，茶树能够迅速地开展旺盛的生长活动，完成一年的生长与发育过程；当环境条件对生长不利时，茶树生长活动逐渐停止，代谢活性降低，以度过不良生态条件。因此，休眠是茶树在长期的进化过程中所形成的一种特性，并且已经在遗传性中固定下来。茶树通常利用芽的休止或休眠，度过不利的生态环境。 导致茶树休眠的因素很多，如温度的高低，日照的长短，水分和养分的多少，甚至光质和光量的不同，都能引起树体休眠。茶芽休眠有两种：一种是新梢轮次之间的“自然休眠”，持续数天或几周，然后自行解除，开始下一轮次的生长；另一种是“被迫休眠”，由于外界日照、温度条件等不能满足茶芽生长的要求所致，持续时间长短不一。在自然界中，冬季严寒到来之前的信号是日照时间缩短，这一信号比低温更为可靠而准确。通常当冬季的白天至少有6周短于11小时15分钟这个临界值时，茶树就要通过一个完全的休眠期。这个黑暗的时间愈长，休眠期也愈长。从杭州地区茶树新梢生育进程观察到，这个临界值正处于霜降时节（10月下旬），白天日照时数为11小时13分钟。因此，茶树冬季休眠主要是由于短的白昼（或长的黑夜）影响树体内部生长调节剂的结果。秋季的低温和短日照是抑制茶芽生育的原因，也是从生育过渡到休眠的条件。在赤道，整年的日照时间都超过12小时，因此热带和近热带地区的茶树终年不出现休眠现象，仅受雨量的影响，茶芽生长有快慢之分，或因树体内部的原因，茶芽呈明显的间隙生长。随着纬度增加，休眠的时间不断递增。我国不同地域茶树休眠期，有如下差异：江北茶区的胶东半岛，茶树休眠起讫时期为10月上旬至翌年4月中旬，休眠期达6个半月；在江南茶区的杭州，茶树休眠起讫时期为10月下旬至翌年3月中旬，休眠期达5个月；在华南茶区的海南省，茶树终年无休眠期。

高温杀青把酶杀死了，茶叶还怎么转化？

生茶正确工艺，在杀青这一环节，强调高温快速杀熟杀透。

那这样以后酶的活性还存在吗？后期靠什么来转化？

这是影响了很多制茶人的一个误区。

这个误区的完整版是：

晒青毛茶在杀青时，温度不能过高。杀青过程中没被杀死的酶，仍有活性对普洱茶的后发酵很重要。温度过高会把酶杀死，不利于后期存放。

实际上，如果按上述做法做，短期内茶涩味会退得快，但从长久来看，茶汤会越变越淡。

要解决这个问题，关键在于，理解普洱茶的越陈越香是什么？以及它是如何发生的？

1.陈化路径

广义来讲，茶叶在存放过程当中，品质一定会变化，或是茶汤刺激性减弱，或是香气由高扬变沉稳等等。这些变化背后，主要是两种陈化路径的的参与：

氧化

氧化能够改变茶叶里很多物质的性状，尤其是儿茶素类的氧化，会使口感变得柔和，但过度氧化会使茶汤汤质发散，趋于无味。

微生物转化

茶叶里的糖苷类物质会滋养一些微生物，微生物进而将茶叶的纤维裂解开，产生溶于水的多糖类，同时使原本捆绑在纤维链中的蛋白质脱离出来，产生游离氨基酸。

2.什么是越陈越香

氧化会使茶叶口感变得柔和，过程中香气可能转趋复杂，但最终汤质会发散，趋于无味。

根据每个人的审美喜好不同，可以主观认为这种变化是好的，特别是中途某些时段香气会变得复杂，很多人因此认为茶陈放之后品质提升了，这也是某种越陈越香。

但这么一来，越陈越香便可以通用于所有茶叶了，甚至不单是茶叶。

因此，我们需要为接下来所讨论的越陈越香下个定义：在陈放过程中，汤质越变越厚，喉韵越变越深、体感越变越强。

认可以上语境，我们可以继续往下推演。

3.越陈越香的机理

微生物消耗存储在茶叶中的简单能量物质（主要是以糖苷形式存储的葡萄糖），进一步活动，分解叶底中的纤维，产生出更多溶于水的多糖类，于是汤质变厚。

同时，纤维链中原本被束缚的蛋白质脱离出来，进一步分解出游离氨基酸，于是喉韵变深。

整个过程中溶于水的总能量物质增多，于是体感变强。

糖苷类很重要，它能够缓释滋养微生物。微生物才是普洱茶越陈越香的关键。

正是微生物转化的作用，使得茶汤变得越来越厚，喉韵越来越深。

4.杀青、酶与糖苷类物质

保留糖苷类的关键，是及时杀死活性酶，减少酶促分解。

如果杀青不透，导致活性酶（尤其是糖苷酶）有一定量的残余，活性物质（尤其是糖苷类物质）会继续氧化分解，短期会显得香甜突出，但是不能长时间滋养微生物。

长远来看，茶叶缺乏微生物转化，茶汤会越来越散，厚度会越来越低。

如何做到正确的杀青？

杀青的目的是利用高温让酶失活。酶是蛋白质，达到85℃时，3分钟内蛋白质即变性了，如果只达到80℃，时间就需要延长到十分钟左右。

如果温度再低，便需要继续延长（但糖苷类就分解过多）；当温度低于60℃，基本就炒不熟了（氧化路径会增强，茶叶变淡）。

理想的杀青是尽可能短时间，尽可能高的温度，在不炒糊的前提下杀熟杀透。