一个世纪以来氧化酶研究的进展(续)

发布时间 : 2020-12-19
一个球的茶叶 怎样骂一个绿茶

李荣林方辉遂

(浙江农业大学茶学系310029)

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Abstract

The investigation on polyphenol oxidase intea sphere has been startedsince the blackteafermentation.Yhe tea fermentation was historicalyconsidered as the action of microorganisms.Afterthen,it was gradually revealledthatthefermentation is the function of the internalenzymes in tea.Finally,it was confirmed thatthis process is mainly completed by polyphenoloxidase.Owing to its special position in tea processing,polyphenol oxidase .Owing to its opecial position in tea processing,polyphenol oxidase has been uninterruptedly studied in teasphere since the end of 18 century and theresearch ckntent has been greatly enlarged anddeepened.This paper tried to summarixe theresearch achievements on tea polyphenol oxidase in past one century

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四、80年代以来的进展

80年代以来对茶叶多酚氧化酶的研究依然兴趣不减,1980年前苏联学者Лруцлзе ГН在早期探索的基础上进一步提出萎凋时PPO分子形态可能发生了变化,PPO可以有高分子态和低分子态两种,萎凋时多酚酶可能发生低分子态向高分子态转化,使总酶活提高[31,7

3]。1981年UllahMA提出萎凋时酶活因失水而下降,用适当的方法复水可使酶活得到一定程度恢复58,59],1986年萧伟祥指出,近期的研究中关于萎凋时PPO活性变化趋势出现了两种完全相反的结论,他认为这是酶提取方法不同所致。丙酮粉法测出的是总酶活,而匀桨法测出的是可溶性的活性。萎凋时可溶性酶活性下降,而总酶活上升[53]。1988年刘仲华研究表明,用丙酮粉法提取酶浸提与不浸提相比酶活有很大不同,浸提12小时酶提取液活力几乎提高一倍[65,66]。实际上早先Roberts已经观察到类似结果[16]。1986年萧伟祥对红茶中残留酶作了详细研究,发现PPO在成品茶中仍有一定活性(31,32)。1981年DixMA用葡萄糖凝胶测定了POD和PPO的分子量,以蓝色糊精等进行校正,01NKCl柠檬酸洗脱,PPO在12Vc有一弱肩峰,分子量142000,另一峰在139Vc,分子量71000,证明PPO具有高分子态和低分子态两种状态。以后有人用高速离心法测定出PPO分子量,如以U(偏微分比容)07-078计算,PPO分子在128000-160000之间,即144000±160000[31]。80年代以来多酚氧化酶同工酶研究受到进一步重视。茶的多酚氧化酶同工酶研究始于60年代中期,1965-1966年竹尾用淀粉凝胶把PPO分成3个组分[45],1966年Gregory用G150也得到3条同工酶。1981年刘维华用聚丙烯酰胺凝胶电泳[62],1983年安徽农学院茶叶系用圆盘电泳[31]分别从萎凋叶中获得了5条同工酶。1988年叶庆生研究发现萎凋中总酶活下降,而且所得6条同工酶活性也呈下降趋势(65)。1988年胡振长研究了杀青过程中多酚氧化酶同工酶的变化,发现杀青后仍存在1-2条同工酶[67],1989年刘仲华研究了红茶制造过程中多酚氧化酶同工酶的动态,证实萎凋中有新的同工酶产生[65]。

1990年施兆鹏研究了黑茶制造过程中多酚氧化酶的变化,结果表明杀青后同工酶由6条减为2条,至渥堆开始时这两条同工酶也消失,渥堆12小时有新的同工酶出现,作者认为这是微生物分泌出多酚氧化酶的结果[69]。

1988年屠幼英测定了多酚氧化酶同工酶的等电点[70],1991年又测定了各同工酶分子量74]。1990年谭振初[71],刘仲华[69]各自独立地证明柠檬酸可促使多酚氧化酶活化。稍早一些时候Tocklai试验站Choughurry M.提出果胶质和果胶酶能抑制PPO活性(51)。

1990年屠幼英、吴小崇证实萎凋时可溶性PPO活性下降,而PPO总酶活性上升,但这种变化与失水无关,萎凋中确有新的同工酶出现,已糖激酶能够促进萎凋叶多酚氧化酶活性的提高而抑制鲜叶多酚氧化酶的活性[72]。1991年屠幼英总结了PPO抑制剂的类型,有硼砂、酚类、亚硫酸钠、Vc、半胱胺酸、二乙基二硫代硫酸钠等[70]。80年代以来多酚氧化酶同工酶在茶树育种和生理上的应用取得显著进展。前苏联学者曾提出PPO活力和PPO酶蛋白含量可作为发酵力的指标[76],我国学者龚景文、陈兴琰(1988)研究了若干茶树品种POD、PPO以及酯酶同工酶的差异,认为同工酶可作为品种分类的依据[77]。浙江农业大学茶学系(1988)建立了同工酶数据处理方法(76)。黄惠华(1991)研究了PPO的等电点,发现叶与花的同工酶等电点基本无异,可以视为遗传特征[76]。

1983年鸟屋尾忠之等人研究了PPO与茶树遗传的关系,认为PPO至少受两组基因的控制,作者估算了PPO广义遗传力和狭义遗传力的大小[79]。

1987年杨跃华研究了同工酶变化与茶抗逆的关系,认为逆境下茶树各酶系统包括PPO都有新的同工酶产生[79],唐继平(1987)[81],StephenSN/(1990)[88]研究了杂交后代PPO遗传的关系,指出PPO主要受优势亲本的左右。

1992年SinghHP研究了花器中多酚氧化酶的变异,结果表明整个花期中PPO在花器中的分布及同工酶特征都保持稳定,因此花器中PPO的特征可作为选种的依据[89]。

1993年王利琴用圆盘电泳分析了PPO同工酶与遗传的关系[82]。新近奚彪等提出用基因工程方法改变茶树体内PPO存在状态的设想[95]。

虽然已可以肯定红茶的变色过程中微生物不起主要作用,但微的可能作用仍不应忽视。

1973年富金原考由绿茶分离出两种产PPO菌株,枝孢霉(Alternarlla Tennis)和链孢霉(Cladosposium C.)[87],苏联学者也分离到两株高产菌:Maceiliair,Corioulous Hirsutu[83,86]

。1987年加藤和冈本顺子研究了微生物PPO用于茶发酵的可行性[84]

。1992年印度学者从茶树叶片中分离出具有较高PPO的活性的7株真菌和3株细菌,并认为细菌更有前途[95]。1990年施兆鹏在研究黑茶渥堆中的PPO活性变化时也曾推测微生物在渥堆叶中分泌了多酚氧化酶[69],所有这些研究为微生物在茶叶制造中的作用提供了新见解。

1983年李名君[86],1985年Jenish C[90]分别对茶叶中已知的酶系作了全面综述,1988年曾洪涛、刘仲华、李远志、张堂恒各自从不同角度讨论了茶叶加工中多酚氧化酶的应用问题[84,85,86],刘乾刚对多酚氧化酶定位问题作了总结[94]。1992年Obenda从植物生理角度讨论了茶的多酚氧化酶CatcholOxdsse区别于Tyrosinade(酪氨酸氧化酶),Laccase(漆酶)的独特性质[89]。1993年曾晓雄,1996年李荣林对茶叶加工中酶的利用现状和前景作了展望,侧重介绍了单宁酶和多酚氧化酶研究和利用中存在的问题[93,95]。

在茶叶加工中单宁酶的应用早已成功,并已应用了固定化酶,受此启发1981年PrabhaT.研究了芒果和茶叶多酚氧化酶的固定化[90]。1992年前苏联学者Chindilis A.研究了多酚氧化酶酶电极的制作技术及酶电极法测定儿茶素的方法[91]。中国和日本学者也开展了相应研究[95]。一般认为茶的多酚氧化酶是一种邻二酚氧化酶,但已有证据表明茶叶的氧化酶提取物确有单酚氧化酶和三元酚氧化酶的活性,可以催化对香豆酸和焦酚的氧化。这表明茶多酚氧化酶是一个复杂的体系[95]。

一个世纪以来茶多酚氧化酶研究的进展是巨大的,但仍有众多的问题需要解决,特别是PPO的生理功能——末端氧化酶的真正地位问题至今仍缺乏明析的概念。与此相关的问题是多酚氧化酶的底物——茶多酚类物质的生理功能的研究仍相当贫乏。此外有关该酶的分子结构的研究

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茶多酚的提取和应用研究进展


摘要 茶多酚是一种新型的天然抗氧化剂,在食品加工、医药、日用化工等领域具有重要的应用。茶多酚的提取和应用研究成为国内外开发“绿色工程”的热门课题之一。本文重点论述茶多酚的提取和应用。

关键词 茶多酚,提取,天然抗氧化剂,食品添加剂,茶叶化学

Extraction and application of tea polyphenol

Gong Changsheng

(Department of Chemical Engineering,Wuhan Institute of Chemical Technology,430073)

Abstract Tea polyphenol,a new natural antioxidant,has important applications in food industry,medicaments and chemical products for daily use.Its extraction and application,one of hot topics in developing green engineering at home and abroad,are discussed in detail in this article.

Key words tea polyphenol,extraction,natural antioxidant,food additives,tea chemistry

茶叶作为中华民族的传统保健饮料已有四五千年的历史。开发茶叶的新用途,开展茶叶的综合利用,尤其是利用低档茶叶或茶叶加工的下脚料来生产高附加值的精细化学品,是一个具有重要意义的研究课题。60年代初,日本科学家发现茶叶提取物中含有一种抗氧化活性成分,各国科学家相继深入研究,证明它是一类多酚化合物,即茶多酚(TP)。

茶多酚不仅是一种新型的天然抗氧化剂[1],还具有明显的抗衰老、消除人体过剩的自由基,去脂减肥,降低血糖、血脂和胆固醇,预防心血管疾病,抑制肿瘤细胞等药理功能,在食品加工、医药、日用化工等领域具有重要的应用[2~4]。茶多酚的提取和应用受到国内外的广泛关注[5~8],开拓了茶叶化学研究的新领域,发展以农副产物为原料的精细化学品,开发“绿色技术”,发展“绿色工程”已成为热门课题。

1 茶多酚的组成和性质

茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称。为白色无定形粉末,易溶于水,可溶于乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯,不溶于氯仿。绿茶中茶多酚的含量较高,占其质量的15%~30%。茶多酚类物质大致可分为6种[8]:黄烷醇类,4-羟基黄烷醇类,花色苷类,黄酮类,黄酮醇类和酚酸类。其中以黄烷醇类(主要是儿茶素类化合物)最为重要,占茶多酚总量的60%~80%。其次是黄酮类,其它酚类物质含量比较少。

儿茶素类化合物是茶多酚的主要成分,其结构式可表示为

若R1=OH,,则为左旋-表没食子儿茶素没食子酸酯(L-EGCG);

R1=OH,R2=H,则为左旋-表没食子儿茶素(L-EGC);

R1=H,则为左旋-表儿茶素没食子酸酯(L-ECG);

R1=H,R2=H,则为左旋-表儿茶素(L-EC)。

儿茶素类化合物的基本结构均为2-连(或邻)苯酚基苯并吡喃衍生物,正是这种结构中具有连或邻苯酚基,作为抗氧化剂的活性就高于一般非酚类或单酚羟基类抗氧化剂。其等摩尔浓度的抗氧化能力依次为L-EGCG>L-EGC>L-ECG>L-EC。从茶叶中提取的茶多酚抗氧化剂是这些儿茶素的混合物。其抗氧化性优于丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)等。国内外学者对茶多酚进行了急性毒性、亚急性毒性和各种药理实验研究,结果表明茶多酚安全无毒。

2 茶多酚的提取方法

2.1 有机溶剂萃取法[6,9,10]

溶剂萃取法提取茶多酚的工艺流程见图1。首先将绿茶叶(或茶叶末)用热水或85%乙醇溶液浸提3次,合并滤液。滤液经真空浓缩,所得的浓缩液用氯仿萃取,脱除其中的咖啡碱和色素等,进而回收咖啡碱。水层用乙酸乙酯进行萃取,得到含有茶多酚的乙酸乙酯溶液。经真空浓缩、干燥,得到茶多酚粗品,并回收乙酸乙酯溶剂。粗茶多酚经过凝胶柱层析等精制提纯,得到茶多酚精品。该法工艺技术比较简单,对TP的提取率为10%~15%。但是有机溶剂用量多。溶剂回收设备及所消耗的能量比较大。

图1 有机溶剂萃取法提取茶多酚工艺流程

2.2 离子沉淀提取法[11~13]

离子沉淀法提取茶多酚的工艺流程如图2。将绿茶叶(或茶叶末)用热水或乙醇溶液浸提,过滤。在滤液中加入沉淀剂使TP沉淀。不同沉淀剂使TP沉淀完全的最低pH值和TP的提取率见表1[13]。过滤,滤液用于提取咖啡碱。沉淀用稀H2SO4转溶,转溶液用乙酸乙酯萃取,得到含TP的乙酸乙酯溶液。经真空浓缩干燥得到茶多酚。该法的特点是减少了有机溶剂的使用量,所得产品中茶多酚含量较高,可达95%以上[11,13]。但是工艺操作控制比较严格,废渣、废液处理量较大。

表1 不同沉淀剂的提取率和沉淀最低pH值

沉淀剂Al3+Zn2+Fe3+Mg2+Ba2+Ca2+最低pH值5.15.66.67.17.68.5提取率/%10.510.48.88.17.47.0

注:表中数据为10次结果的平均值。

图2 离子沉淀提取茶多酚工艺流程

2.3 吸附分离提取法[7,14]

吸附分离法提取茶多酚的工艺流程见图3。将绿茶叶(或茶叶末)加热水浸提3次,合并提取液。茶叶提取液通过高分子吸附剂进行吸附,然后用90%乙醇溶液洗脱,使吸附剂上吸附的TP脱附于乙醇中,经减压蒸馏回收乙醇。浓缩液经真空干燥或喷雾干燥得到茶多酚。该法工艺技术简单,能耗低,但需要对TP选择性强的高吸附量的吸附剂。

此外,还有低温纯化酶提取法[7],盐析法[15]等。

3 茶多酚的用途

3.1 在食品加工中的应用

茶多酚是一种新型的天然抗氧化剂,其抗氧化作用在于儿茶素分子结构中酚性羟基特有供氢体的活性,能与脂肪酸在自动氧化过程中产生的游离基结合,中断脂肪酸氧化的连锁反应,抑制氢过氧化物的形成,达到抗氧得鲜的目的。而且茶多酚的抗氧化性能比BHA、BHT高2~3倍,且安全无毒。一些国家正试图用茶多酚替代BHA、BHT、TBHQ等合成抗氧化剂。1991年7月我国食品添加剂标准化技术委员会批准将茶多酚正式列为食品添加剂。茶多酚可广泛应用于动植物油脂、油基食品、焙烤食品、糕点、乳制品、肉制品、水产品等作为抗氧保鲜剂。

图3 吸附分离法提取茶多酚工艺流程

3.2 在医药保健中的应用

现代医学研究认为,人体内过量的自由基是引起人体衰老、致病、致癌的重要因素之一,而茶多酚能清除人体内过剩的活性自由基,提高人体抗衰老、抗辐射、抗肿瘤的能力[3,4]。实验表明,茶多酚中儿茶素类化合物对O-2、OH自由基的清除率达到98%以上,清除速率常数在109与1014数量级,对活细胞(PMN)产生的氧自由基的综合清除效果优于维生素E和维生素C[16]。茶多酚还有去脂减肥,降低胆固醇和血糖、血脂,防止动脉粥样硬化,预防心血管疾病等多种药理功能。因此,目前国内外正研究将茶多酚制成医疗保健药品,以提高人体的抗衰老、增强免疫能力和新陈代谢作用。

3.3 在日用化学品中的作用

由于茶多酚具有明显的“三抗”(抗衰老、抗辐射、抗肿瘤)作用,消除过剩自由基、抑菌抗毒、消除异味等,而且是安全无毒的天然制成品,因此,在日用化学品尤其在保健化妆品中具有重要的应用。

此外,利用茶多酚的强还原性和消除

禅茶:一个茶杯和一个茶壶的智慧


禅茶:茶杯在上茶壶在下

一个满怀失望的年轻人千里迢迢来到了法华寺,对住持释园说:“我一心一意要学丹青,但至今没有找到一个能令我佩服的老师。”

释园笑笑,问:“你走南闯北十几年,真的没遇到一个好老师?”年轻人深深叹了口气说:“许多人都是徒有虚名,我见过他们的画,有的画技还不如我呢!”释园听了,淡淡一笑说:“老僧虽然不懂丹青,但也颇爱收集一些名家精品。既然施主的画技不比那些名家逊色,就烦请施主为老僧留下一幅墨宝吧。”说着便吩咐一个小和尚拿来了笔墨纸砚。

释园说:“老僧最大的嗜好,就是爱品茗。施主可否为我画一个茶杯和一个茶壶?”年轻人听了,说:“这还不容易?”于是调了一砚浓墨,铺开宣纸,寥寥数笔,就画出一个倾斜的水壶和一个造型典雅的茶杯。那水壶的壶嘴正徐徐吐出一脉茶水来,注入到那茶杯中去。年轻人问释园:“这幅画您满意吗?”

释园微微一笑,摇了摇头。释园说:“你画得确实不错,只是茶壶和茶杯放错了位置。应该是茶杯在上,茶壶在下呀。”年轻人听了,笑道:“大师为何如此糊涂,哪有茶杯反在茶壶之上的道理?”

释园听了,又微微一笑说:“原来你懂得这个道理啊!你渴望自己的杯子里能注入那些丹青高手的茶,但你总把自己的杯子放得比那些茶壶还要高,茶怎么能注入你的杯子里呢?只有把自己放低,才能吸纳别人的智慧和经验。”

年轻人思忖良久,终于恍然大悟。

思茅茶园小绿叶蝉防治研究取得进展


云南思茅茶园建设与茶园小绿叶蝉防治研究历经16年探索,近日通过云南省专家组验收。

专家组鉴定认为,茶叶是云南的主要支柱产业,思茅是云南的主要茶叶产区,课题的重大突破,不仅对思茅的茶叶发展,而且对云南茶叶产业发展均有重大意义。思茅生态茶园建设取得了重大进步,大叶种有机茶园建设已初具规模;茶园小绿叶蝉种群控制已经取得成功。专家认为,项目不仅取得了重大的社会生态效益及经济效益,而且对易地茶产业发展、山区农村的扶贫开发和脱贫致富以及边疆少数民族地区的稳定具有重要的意义,建议在大叶种适宜地区推广运用。

思茅茶园建设与茶园小绿叶蝉防治研究课题是云南省"八五"科技攻关项目,由中科院西双版纳热带植物研究园和云南龙生绿色产业(集团)有限公司合作承担,从1989年开始用了16年时间分四个阶段进行。中国科学院西双版纳热带植物园研究员、云南龙生绿色产业(集团)有限公司科技顾问扈克明在接受记者采访时说,通过茶园建设、无性系良种茶园基地的建设、生态茶园的建设、有机茶园的建设,使思茅市的茶园建设进入到一个高层次的建设阶段。而茶园小叶蝉是茶园里面的主要害虫,由于它世代多、重叠多、虫口量大,是目前国内及思茅茶园里的主要害虫之一,对有机茶园的建设、茶叶的品质影响比较大。通过十几年的工作,茶园建设已经进入到了有机茶园建设的高层次阶段。对小绿叶蝉的防治也已经形成了综合防治体系,使茶园小绿叶蝉的虫口密度降到了国家允许的指标之下,保证了茶园建设和茶叶生产的高质量。

【深度】科学饮茶之健康临床研究进展


自《神农本草经》记载“神农尝百草,日遇七十二毒,得荼而解之”以来,茶的药用价值由来已久。如今,茶作为世界三大饮料之一,其对人体健康的促进效应是世界性研究热点之一。迄今为止,已有大量的体外实验和动物模型研究表明茶与其功效成分对包括癌症、心血管疾病、神经退行性疾病等诸多危害人体健康的疾病具有潜在的防治功效。同时,随着研究的深入,茶叶健康功效的作用机理也被逐渐厘清。这些研究成果为茶与健康临床试验的开展提供了科学支撑,而相关临床数据是决定能否将茶叶开发为药物造福人类的最直接证据。

茶与心血管疾病

随着人口老龄化趋势进一步发展,如何提高人们生命质量已成为全球关注的热点,尤其是心脑血管疾病已成为当今人类第一杀手,因此对其防治的意义不言而喻。近年来,已有流行病学研究表明,亚洲人和欧美人相比,罹患心血管疾病的比例明显少很多,除去遗传因素外,很多学者认为这可能与亚洲人有饮茶的习惯密切相关。现已有大量的体内外模型研究表明茶与茶多酚可以通过改善血管内皮功能,调节血管张力,改善糖代谢,增加胆固醇逆向转运,抑制泡沫细胞的形成,抑制氧化应激,调节免疫和影响血小板功能(黏附,聚集)来防治高血脂症、高血压、血栓、动脉粥样硬化和冠心病等心血管疾病。目前,我国已经成功将茶多酚开发成了治疗包括高血压、动脉粥样硬化及冠心病等在内的心血管疾病的中成药(心脑健)。

高血脂症

高脂血症(hyperlipidemia),包括血脂代谢发生紊乱;脂肪代谢或转运异常;血浆中一种或几种脂质浓度,包括血浆总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)水平过高或血浆高密度脂蛋白(HDL)水平过低;人体血浆中TC、TG和各种脂蛋白含量高于同龄正常值者。高脂血症是中老年人常见的疾病之一,也是心血管疾病的一个重要危险因素。

Tokumaga等在日本对13916名健康工人(8476名男性,5440名女性)进行流行病学调查发现,绿茶饮用量与血浆中TC的浓度成反比。Zheng等于2011年对相关文献全面检索之后,对符合要求的14项随机对照实验进行meta分析表明,绿茶能显着降低血清中TC和LDL-C浓度。虽然已有大量流行病学表明绿茶以及茶多酚具有降血脂作用,但仍有不一致的结论。Princen等和Choi和Kim的流行病学调查则认为饮茶对高血脂的预防并没有积极的效果。这些流行病学的不一致性可能是由于调查人群的复杂性,饮食习惯的差异,调查方法不同等所致,所以需要临床试验加以验证。

应之和采用双盲法,对治疗组及对照组,分别给予口服茶多酚胶囊100mg/粒,维生素C片剂100mg/粒,两者均1日3次,每次2粒,结果表明,口服茶多酚胶囊8周后患者血脂各参数(TC、TG、HDL-C、LDL-C)均有显著改善,对高胆固醇血症总有效率为89.7%,对高甘油三酯血症的总有效率为92.8%,并且未见明显药物不良反应。

Maron等对中国6个地区医院的240名轻度或中度高脂血症患者进行双盲、随机、安慰剂作对照的试验,以评定茶多酚对患者TC、LDL-C、HDL-C和TG水平的影响,结果显示,12周后,服用茶多酚的患者与受试前自身相比,TC和LDL-C降低,HDL-C升高,而安慰剂组无显著效应。

近期,Nagao等在日本对240名内脏脂肪型肥胖患者进行的一项为期12周的平行双盲,多中心临床试验实验发现,每日摄入富含583mg儿茶素绿茶提取物的试验组,其体内脂肪,收缩压(SBP),LDL-C水平显著降低,表明服用这种提取物有助于减少肥胖和心血管疾病的风险。

高血压

高血压(Hypertension)是一种由多基因遗传与环境因素交互作用而产生的以动脉血压升高为特征的临床综合征。由饮食的调整带来血压的变化可对高血压和心血管疾病的患病率有显著影响。茶作为全球流行饮料,已有大量资料报道茶中主要功效成分茶多酚具有降血压,减慢心率及增加冠状动脉流量的作用。

Hodgson等设计了一项随机双盲安慰剂对照试验,证明每天饮用3杯红茶持续6个月能够显著降低人体收缩压(SBP),舒张压(DBP)。Clement和Ernst对PubMed和Cochrane图书馆中,关于绿茶饮用习惯与化学预防和心脑血管防治方面的临床试验,进行非系统性文献回顾,认为饮用绿茶可以预防高血压,降低中风的风险。临床上,牟乃洲等用茶色素联合卡托普利治疗原发性高血压80例,并随机设卡托普利的对照组60例行对比观察,结果表明每天口服125mg茶色素(心脑健)、25mg卡托普利3次的治疗组,其治疗高血压的有效率达81%,显著高于对照组60%,而且治疗组有明显改善微循环的功效。说明茶色素联合卡托普利对原发性高血压患者有较好的疗效并能起到巩固稳定血压,改善微循环的作用。。

已有研究发现,高血压病除有血液动力学异常外,并伴随一系列血液流变学改变,而且患者往往存在明显的自由基代谢紊乱现象。所以,对高血压患者的治疗除了直接作用于血压外,还可通过调节氧自由基和血液流变学改善病情。柯永胜和徐晓华观察茶多酚对原发性高血压患者(38例)氧自由基和血液流变学的影响,并与用肠溶阿司匹林治疗的30例作对照。临床观察表明,TP能明显提高红细胞SOD活性,降低血清MDA水平,降低全血比粘度、血浆比粘度和血浆纤维蛋白原水平,其药理效应优于肠溶阿司匹林。

血栓

血栓(Thrombus)是血流在心血管系统血管内面剥落处或修补处的表面所形成的小块,由不溶性纤维蛋白、沉积的血小板、积聚的白细胞和陷入的红细胞组成。血栓形成是一种涉及许多彼此相互作用的遗传和环境因素的多因素变化的过程。

血管内皮在维持血管内平衡的过程起着十分关键的作用。其作用主要有屏障功能,接受和传递信息以调节血管收缩或扩张,分泌血管活性物质,其生成的NO对维持血管内皮功能正常有着巨大的作用,而血管内膜损害是血栓形成的主要条件。Ras等对从Medline搜索的340项与茶和血流介导的舒张功能(FMD)有关的研究进行meta分析,表明每天饮茶2-3杯能大力提高血管内皮功能。

Jochmann等对红茶和绿茶改善血管内皮功能进行了研究,结果表明绿茶或者红茶不仅使内皮细胞NO合酶的活性显著增加,而且可以引起老鼠主动脉环内皮依赖的血管舒张,同时还发现饮用绿茶或者红茶2h后可以增加健康女性体内血流介导的血管舒张(FMD)。

大量的临床流行病学及实验室研究资料表明同型半胱氨酸(Hey)是动、静脉血栓形成的独立危险因素。裴晶晶等研究发现茶多酚可逆转Hcy引起的PAI-1/t-PA比值紊乱,使比值维持正常,从而修复Hey引起的内皮细胞纤溶损伤,增强纤溶功能,防止血栓的发生。

此外,茶多酚还通过抗凝血、促纤溶作用,防止血栓形成。洪允祥等通过对54例冠心病患者15年动态观察证实茶多酚可使血浆纤维蛋白原含量显著下降,抗凝血酶Ⅲ含量升高及活性稳定,使凝血因子Ⅷ相关抗原显著减少,并明显抑制血小板的聚集,预防血栓形成的作用。

动脉粥样硬化

动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是严重危害人类健康的常见病,是以血管内皮细胞完整性破坏,巨噬细胞游移,平滑肌细胞和成纤维细胞增生,以及细胞内外脂质积聚为主的一种病理过程;是以内膜粥样斑块或纤维斑块形成为病变特征的动脉疾病。

宋小鸽等对50例心血管病患者进行临床试验发现,服用茶多酚口服液后,患者动脉硬化指数(AI)与服药前比较有明显下降,表明茶多酚有抗动脉硬化的作用。

关于AS的发病机制存在多种假说,但具体机制至今尚未有定论。近年来研究表明低密度脂蛋白发生氧化修饰成氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)是导致动脉粥样硬化(AS)发生的独立危险因素。因此有效地抑制LDL的氧化修饰,对防治AS具有重要的意义。有研究表明,茶多酚是LDL氧化的强抑制剂,能有效地抑制LDL的氧化修饰来预防AS。

Inami等在40名健康志愿者身上就儿茶素对血浆氧化修饰的LDL的影响进行了研究,结果发现4周后每日口服500mg儿茶素的儿茶素组,其血浆氧化修饰的LDL水平明显降低,由9.56±9.2U/mL降至7.76±7.7U/mL。

但也有不一致的结论,Davies等在患有轻度高胆固醇血症的成年人身上未发现喝红茶能改变血浆中OX-LDL水平。

冠心病

冠心病(Coronaryarterydisease,CAD)又称冠状动脉性心脏病,是由于冠状动脉粥样硬化使血管腔狭窄或阻塞导致心肌缺血缺氧引起的心脏病。

已有大量流行病学资料表明,饮茶对冠心病的发生存在保护性作用。Geleijnse等,Mukamal等,Pyshchyta等对饮茶与心肌梗死的关系进行流行病学调查,表明喝茶可显著降低心肌梗死的发病率和病死率。deKoningGans等对37514个人进行13年的调查分析证明,每天饮茶≥6杯可显著降低冠心病死亡率。Ruxton和Mason于2011年2月检索了红茶消费与冠心病关联的流行病学研究,10项列队研究,1项病例对照研究,其中8项证实了饮用红茶(每天≥3杯)可显著降低患冠心病风险。但并不是所有流行病学研究结果都一致,Sesso等和Hertog等的调查结果则表明饮茶与降低冠心病发病率之间无明确关系。

临床上,Lagiou等在希腊进行的一项病例对照研究表明一种大量存在于茶中的多酚类化合物Flavan-3-ols与冠心病的发病率呈现负相关,且每天摄入21毫克Flavan-3-ols,冠心病的患病风险就降低24%。Sano等在日本对203例行冠状动脉造影患者研究发现,每天饮用绿茶越多,患者冠状动脉显著性狭窄(左主干狭窄大于50%或者其他主要血管狭窄大于75%)的发生率越低。

在中国,焦世兰等针对冠心病的患者,采用200mg/粒的茶多酚胶囊口服,200mg/次,3次/d,对照组采用口服等量淀粉胶囊安慰剂,200mg/次,3次/d。治疗期间均常规口服硝酸异山梨醇酯10mg,3次/d,肠溶阿司匹林75mg睡前服,停用其他药物,疗程4周。结果表明,茶多酚治疗能改善患者心绞痛、呼吸困难、心慌胸闷、心悸、气短、疲乏无力等临床症状,治疗总有效率为90%明显高于对照组(53.33%),这可能是因为茶多酚通过对冠心病OX-LDL明显的氧化抑制作用,而达到抗动脉硬化、防治冠心病症状加重的作用。

糖尿病肾病

糖尿病肾病(DN)是糖尿病长期代谢异常引起肾小球损伤的一种疾病,是糖尿病的严重并发症,也是影响糖尿病预后最重要的因素之一。

为观察从茶叶中提取研制而成的纯中药制剂茶色素胶囊对糖尿病肾病(DN)的治疗效果,采用口服降糖药或胰岛素治疗的常规组与常规治疗加用茶色素胶囊治疗的茶色素组作对比。结果表明,茶色素能使DN患者的重要症状明显改善,降低尿白蛋白、空腹血糖值和糖基化血红蛋白的含量(P<0.05—0.01),对血液流变性和自由基代谢指标,也有较好的改善作用,且疗效优于常规组(P<0.05—0.01),提示茶色素是通过其有效成份的抗炎,抗变态反应,改善血液流变性,抗氧化、清除自由基作用而发挥其临床效用的。

鉴于心血管疾病往往又是多种高危因素相互交织的结果,导致了目前此类患者需同时服用不同药物的局面,这不可避免造成不良反应发生率增加,另又造成大量的经济浪费,为此研发一种标本兼治、疗效全面、服用方便的药物已成当务之急。通过对茶中功效成分的研究,发现茶多酚、茶色素等具有明显的调理血脂、降低血压、增强血管内皮功能、降低血液黏度、抗氧化等作用。目前,我国已经成功将茶多酚开发成了治疗包括高血压、动脉粥样硬化及冠心病等在内的心血管疾病的中成药(心脑健),并已在临床上推广应用。

茶学博士,教授,博士生导师。浙江大学茶学系副系主任,浙江大学茶叶研究所副所长,浙江大学浙西南农推中心主任,浙江省茶叶学会秘书长,浙江大学茶文化与健康研究会秘书长,国家一级评茶师,国家职业技能(评茶员/茶艺师)竞赛裁判员、高级考评员,浙江图书馆文澜讲坛客座教授。

茶树阶段性返白现象的研究—RuBP羧化酶与蛋白酶的变化*


提要 安吉白茶(Camellia sinensis)是具有阶段性返白现象的温敏突变体。利用SDS-PAGE电泳分析了返白和复绿过程中各阶段叶片可溶性蛋白组分,尤其是RuBP羧化酶大、小亚基的变化,并利用同位素法测定了此过程中RuBP羧化酶活性的变化。利用内源基质法测定了蛋白酶活性的变化,并分析了其变化与蛋白质源库代谢、叶绿素变化之间的相关性。发现安吉白茶在返白与复绿过程中叶片可溶性蛋白的主要变化是RuBP羧化酶大、小亚基含量上的差异,这种差异与RuBP羧化酶活性的变化是相一致的。同时返白阶段蛋白酶活性较高,可溶性蛋白含量降低,是造成游离氨基酸总量明显积累的直接原因。

关键词 安吉白茶;阶段性返白;温敏突变体;蛋白酶; RuBP羧化酶

Studies on the Stage Albescent Phenomenon in Tea

——the Changes of RuBPcase and Proteinase

Li Sufang Chen Ming Yu Fulian Cheng Hao

(Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008)

Abstract The variation of large and small subunits of RuBPcase from temperature-sensitive mutant of Anjibaicha (Camellia sinensis) during its stage albescent process was investigated as well as the changes of the enzyme activities. The relationship between the levels of the RuBPcase subunits and the activities of proteinase was also discussed. It was found the levels of both large and small subunits were low at the albescent stage and became normal after leaves recovered to green, which corresponded with the enzyme activity change. Meanwhile, the high activity of protease and the lowering of leaf soluble protein content. At the albescent stage were the direct reasons for the accumulation of free amino acids.

Key words Anjibaicha;Stage albescent mutation;Temperature sensitive mutant;Proteinase; RuBPcase

我们业已报道了温敏叶色突变体安吉白茶在返白过程中伴随着叶片色素含量的可逆性变化,其茶多酚含量、氨基酸含量与组成等都有对应的相关变化〔1,2〕,尤其是返白阶段的氨基酸总量比对照品种高出许多,使以此突变体为原料制作的成品茶滋味较为鲜爽;不仅如此,在返白与复绿过程中还有叶绿体数量分布和叶绿体超微结构〔3〕的可逆性变化。但以安吉白茶无性系群体所产的种子进行繁殖的有性后代在白化性状上出现了分离,大多数种子后代不再具有返白特征,只有少量种子苗能保持其返白现象。本文主要探讨了在安吉白茶返白与复绿过程中,叶片RuBP羧化酶和蛋白酶的变化情况。

1 材料与方法

1.1 试验材料

种植在杭州中国农业科学院茶叶研究所苗圃和浙江省安吉县林科所白茶基地的无性系安吉白茶茶苗。并采用种植于本所苗圃的安吉白茶部分实生绿苗作为可溶性蛋白组分分析的对照材料。

1.2 试验方法

1.2.1 叶片可溶性蛋白组分分析

1.2.1.1 叶片可溶性蛋白提取 白茶和对照样各500mg,液氮冻干。加3.5ml可溶性蛋白提取液(30mmol/L Tris-HCl,pH 8.7;1mmol/L DTT;1mmol/L EDTA;5mmol/L MgCl2)、0.1g水不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及少量石英砂,冰浴研磨。4℃,8640r/min离心10min。取200μl,加1ml冷丙酮(内含10mmol/L巯基乙醇),摇匀后置于-20℃冰箱1h,用TGL-16离心机10000r/min离心5 min,收集沉淀,减压干燥,-20℃保存备用。

1.2.1.2 可溶性蛋白SDS-PAGE凝胶电泳〔8〕 浓缩胶浓度3%,分离胶浓度12%,含0.1%SDS。电泳后,凝胶用0.25%考马斯亮蓝R250、50%甲醇、10%乙酸固定染色6h,然后用7%乙酸和15%甲醇脱色。胶片用岛津CS-930薄层扫描仪595nm波长扫描。分子量测定用低分子量标准蛋白含兔磷酸化酶B(97400 u)、牛血清白蛋白(66200 u)、兔肌动蛋白(43000 u)、牛碳酸酐酶(31000 u),胰蛋白酶抑制剂(20100 u)和鸡蛋清溶菌酶(14400 u)。

1.2.1.3 可溶性蛋白含量、蛋白酶活性与游离氨基酸测定 可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝染料结合法〔6〕,在岛津UV-265分光光度计上测吸光值,并计算蛋白浓度。蛋白酶活性测定采用内源基质法〔7〕。游离氨基酸含量测定用国标法GB8312-87。

1.2.2 RuBP羧化酶提取及酶活力测定

1.2.2.1 RuBP羧化酶提取〔4,9〕 鲜叶去叶脉,液氮冷冻24h,再保存于-30℃冰柜待用。取10g上述保存的材料,加入80ml预冷的新鲜提取液(50mmol/L磷酸缓冲液,pH7.4,内含1mmol/L EDTA,5mmol/L巯基乙醇,10%甘油),及2g水不溶性PVP,预冷的组织捣碎机匀浆,快速5s,慢速5s,重复3次。然后经4层预冷纱布过滤,滤液经11900r/min离心20min,收集上清。

1.2.2.2 RuBP羧化酶活力测定 采用同位素方法测定。总体积为800μl的反应混合液含100μmol Tris-HCl缓冲液(pH7.8),10μmol MgCl2,8μmol NaH14CO2 (2μCi),2μmol DTT和100μl上述提取的RuBPcase酶液。25℃预温10min使酶活化,加入0.5μmol RuBP使反应开始。5min后,加入800μl HCl终止反应,90℃烘箱干燥。PACKARD 1900CA双道液体闪烁计数器测定,按以下公式计算酶活力:

U=DPM×3.997×60×V/(2.22×106×5×10-1)(CO2μmol.g-1.h-1FW)

式中:3.997为每微居里(μCi)14C相当于CO2的微摩尔数(μmol);60为分钟数(min);V为每克鲜重植物得到的酶液原液的体积(ml);2.22×106为每分钟内1μCi14C的蜕变数;5为反应时间(min);10-1为反应体积中酶液的体积(ml)。

2 结果与分析

2.1 叶片可溶性蛋白的电泳分析

叶片可溶性蛋白组分测定材料为本所苗圃3年生茶苗,自4月9日起每隔一周取样至5月16日叶片复绿时止。各时期样品电泳后进行比较,未能发现有明显的组分变化,仅发现有两条带的强度在不同时期有显著差异。将电泳胶片在薄层扫描仪上扫描后,其结果(图1)证实这两条带的含量在白化期与复绿后差异较大。根椐与低分子量标准蛋白质的对比计算,确定它们的分子量分别为54.2ku和14.9ku左右。经与菠菜RuBP羧化酶提纯品的多次比较,确认其为RuBP羧化酶大、小亚基。由图1可见,白茶突变体RuBP羧化酶大、小亚基含量在白化初期与全白期均处于较低水平,复绿后急剧升高,两个亚基的变化幅度基本相近。

因为安吉白茶突变体原发现于安吉山区一农家茶园,已无法找到产生这一突变体的原茶树种群来作为对照,为确证这种RuBP羧化酶大、小亚基含量的变化确实是与突变体的返白性状有关,而不是叶片本身发育的原因,选择了安吉白茶突变体的种子后代中不表现返白特性的植株作为对照,对比了突变体与其有性后代在各时期RuBP羧化酶大、小亚基含量上的差别。种子后代叶片可溶性蛋白电泳胶片的扫描结果如图2所示。根椐电泳图谱的对比,也未能发现白茶突变体与其有性后代在叶片可溶性蛋白组分上有明显差异,但作为对照的突变体有性后代RuBP羧化酶两亚基在各时期的水平基本没有变化,与白茶复绿期水平接近,大大高于白茶返白期水平。该结果与对照植株不表现白化突变的现象一致,说明白茶RuBP羧化酶亚基的含量变化确实是由突变引起的。

EA:返白初期;FA:全白期;HG:复绿中期;FG:全复绿期;LS:RuBP羧化酶的大亚基;SS:RuBP羧化酶的小亚基

EA: Early albescent stage; FA: Fully albescent stage; HG: Half green stage; FG: Fully green stage;LS: The large subunit of RuBPcase; SS: The small subunit of RuBPcase

图 1 安吉白茶突变体返白过程不同阶段叶片可溶性蛋白SDS-PAGE电泳结果扫描图

Fig.1 SDS-PAGE scanning profiles of soluble leaf proteins during Anjibaicha albescent progress

EA:相当于白茶返白初期; FA:相当于白茶全白时期;FG:相当于白茶全复绿时期;LS:RuBP羧化酶的大亚基;SS:RuBP羧化酶的小亚基

EA: The same time to early albescent stage; FA: The same time to fully albescent stage;FG: The same time to fully green stage;LS: The large subunit of RuBPcase; SS: The small subunit of RuBPcase

图 2 安吉白茶有性后代不同阶段叶片可溶性蛋白SDS-PAGE电泳结果扫描图

Fig.2 SDS-PAGE scanning profiles of the soluble leaf proteins of Anjibaicha seedling progenies

2.2 返白过程中RuBP羧化酶的活性变化

为进一步确证RuBP羧化酶在返白与复绿过程中的变化,采用同位素方法测定了白茶突变体返白过程各时期RuBP羧化酶的活性。其结果(图3)表明该酶活性在返白初期即较低,随叶片返白程度的加深又略有下降,然后又随叶片的逐步复绿而渐渐升高,其变化趋势与返白过程中叶绿素的变化完全一致。这一结果不仅与叶片可溶性蛋白的电泳结果一致,也和已观察到的返白复绿过程中叶绿体结构的解体与恢复现象〔3〕一致,说明安吉白茶在返白期叶绿体的结构与功能同时受到了严重的破坏,而在复绿期又得到了重建。

EA:返白初期;FA:全白期;SG:复绿初期; HG:复绿中期;FG:全复绿期

EA: Early albescent stage; FA: Fully albescent stage; SG: Slightly green stage; HG: Half green stage; FG: Fully green stage

图 3 安吉白茶不同返白复绿阶段RuBP羧化酶活性的变化

Fig.3 Variation of RuBPcase activity at the different albescent stages of Anjibaicha

2.3 返白过程中蛋白酶的变化

RuBP羧化酶大、小亚基含量的同时下降提示我们需对蛋白的降解作一分析,为此测定了白茶突变体返白与复绿各阶段蛋白水解酶的活性、可溶性蛋白含量和游离氨基酸总量。其结果(图4)表明,与随后的复绿阶段相比,返白期蛋白水解酶活性总体较高,可溶性蛋白含量较低,两者有较好的负相关性;而总游离氨基酸明显积累,其峰值与蛋白水解酶活性最大值几乎同时出现。而复绿后蛋白水解酶活性逐步降低;与此对应,可溶性蛋白含量随复绿过程逐步升高,同时游离氨基酸含量下降,游离氨基酸库容的变化与可溶性蛋白含量变化呈较好的负相关性。因此安吉白茶在返白阶段游离氨基酸库容的增大,很可能是由于蛋白酶活性的增大,导致了蛋白质的大量水解引起。

EA:返白初期;FA:全白期;HG:半复绿期;FG:全复绿期

EA: Early albescent stage; FA: Fully albescent stage; HG: Half green stage; FG: Fully green stage

图 4 安吉白茶不同返白复绿阶段可溶性蛋白,游离氨基酸和蛋白酶活性变化

Fig.4 Variation of proteinase activity, soluble protein level and free amino acid content at the different albescent stage of Anjibaicha

3 讨论

RuBP羧化酶是一种重要的叶蛋白,几乎占叶片可溶性蛋白的50%左右,催化光合作用中CO2的固定。安吉白茶在返白与复绿过程中叶片可溶性蛋白的主要变化是RuBP羧化酶大、小亚基含量上的差异,这种差异与RuBP羧化酶活性的变化是相一致的,与返白过程中蛋白酶活性的变化呈负相关关系。许多学者认为,RuBP羧化酶是植物蛋白酶水解的最佳底物,因此造成RuBP羧化酶大、小亚基含量在白化期下降的原因,很可能是由于突变诱发的蛋白酶活性升高导致了RuBP羧化酶蛋白的大量水解。因此,蛋白酶活性在白化期的显著上升是安吉白茶白化期氨基酸总量增加的直接原因。

高等植物的RuBP羧化酶是一个由核基因和质体基因共同编码的基因产物,其大亚基的合成由叶绿体基因组中单一基因编码,而小亚基的合成则由核基因组中的多基因编码。在水稻中,由叶绿体基因组缺失所导致的花培白化苗,其RuBP羧化酶大亚基水平极低而小亚基较为正常〔5〕,而核基因突变产生的水稻白绿苗〔5〕,则两个亚基同时受到影响。安吉白茶在其返白与复绿过程中,RuBP羧化酶大、小亚基含量基本上同时下降与上升,与水稻白绿苗的情形较为类似。且其种子后代中只有少量种子苗能够保持返白特征,因此安吉白茶的返白突变不可能是仅仅由于质体基因组突变产生。

*国家自然科学基金与浙江省自然科学基金资助项目。

松萝茶一个神奇的传说


“今茶之上者,松萝也,虎丘也,罗岕也,龙井也,阳羡也,天池也。”

松萝茶芽实、气香、味清,记载于唐,盛名于明。最重要的是,此茶为药,可化食通便、消火祛痰,降血压、解顽疮。

松萝茶,很小清新的一个茶名,产于安徽省休宁县城北的15千米的松萝山上,以山命名,是名松萝茶。都说高山云雾出好茶,此茶生长在气候温和、雨量充沛、云雾弥漫、土壤肥沃、风景秀丽的高山上,使得松萝茶叶片肥厚鲜嫩、条索紧实,郁浓翠丽,而且茸毛明显。

冲泡之后,茶香四溢,闻之神往,茶汤鲜活明亮、翠绿通透,滋味浓厚、香气高扬。

关键是,它的药用价值非常之高。清代的王椷在他的《秋灯丛话》中记载:北方有个姓贾的商人,在南方行商,喜欢吃猪头,食量特别大,一次能吃几个人的饭量。有位医术很高的人见到贾姓商人之后,便问他的仆人,他的仆人说:“每顿饭都是这样,已经十来年了。”

这位医者听过之后说:“再这样下去,疾病马上就会显现出来,即便是医生也很难再救治了。”

这位医生就等着贾姓商人回来,然后跟着他回到北方,接着观察贾姓商人,发现他并没有任何异样状况出现。特别惊讶,于是便再次询问他的仆人,他的仆人说:“我家主人每次吃完饭之后,都会喝松萝茶。”

医生便恍然大悟:“原来如此,这种病只能用松萝茶解啊!”于是便回去了。

从这一个小小的故事之中我们便能看到松萝茶的妙用,我们虽然不能真的考证是真是假,但是其药用功效可见一斑啊!

其实关于松萝茶还有一个神奇的传说:说在松萝山上有个香火鼎盛的寺庙,庙门前有两口年代久远的水缸,缸水颜色翠绿可人。

一次一个外地的香客看到之后,便想买走这两口水缸,付了300两金子作为定金。老方丈顿时觉得这两口缸很值钱,就让小沙弥们去清洗干净藏了起来,等香客来取。

香客本想要那两缸水的,老方丈觉得自己帮了倒忙,懊悔不已。香客便建议,不如在倒水的地方种些茶叶,想必一定有所成。事实果真如那名香客所说,长出一片与众不同的茶叶,因为在松萝山上,便命名为松萝茶。

两百年之后,休宁此地流行伤寒痢疾,大家纷纷来寺中拜佛,但凡拜了佛喝了寺院中给的松萝茶的人,疾病都相继好了,于是方丈便给每位来的客人都赐赠一包松萝茶,面授“普济方”:病轻者沸水冲泡频饮,二三日即愈;病重者,用此茶与生姜、食盐、粳米炒至焦黄煮服,或者研碎吞服,二三日也愈。因为松萝茶,伤寒痢疾的流行被遏制住了。

松萝茶可消食化痰、舒缓头痛、润肠减肥……总之,松萝茶名字虽然很小清新,但是药效多多,喜欢食肉减肥的朋友大可以一试。

给您一个喝茶的理由!


茶味,就像人生,万般磨砺千般苦。苦过后更加清,万般过去亦无味,但有领悟留下。茶生活,让你的生活更美。

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茶叶含有茶多酚

茶多酚的主要作用就是清除血液中的有害物质自由基毒素。自由基是使人体衰老的主要因素,茶多酚通过清除自由基而提高有益酶的活性和降低有害酶的活性。同时茶多酚还可以抑制紫外线照射后引起的脂质过氧化,从而起到保护皮肤的作用。

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